차세대 시퀀싱의 발전

NGS에서 단거리 읽기 기술의 중요성은 의심의 여지가 없지만 다른 기술은 너무 중요합니다

• 차세대 시퀀싱 (NGS) 시장은 Illumina에 의해 주도되어 왔으며, 많은 연구자들이 경쟁 부족으로 인해 적어도 단기 판독 시퀀싱에 대한 비용면에서 NGS 발전 속도가 느려지고 있다고 불평하고 있습니다 .

  Illumina의 주요 제품인 HiSeq X 시퀀싱 플랫폼 출시 이후 연구용 전체 게놈 비용은 약 1,000 달러로 꾸준히 유지되었습니다.

  BGI의 Revolocity (Complete Genomics의 기술을 기반으로 함)의 가능성이있는 유일한 경쟁은 그 이후로 사라졌습니다. 그러나 다른 분야에서 NGS 사용을 여는 많은 흥미 진진한 개발이있었습니다.

  엄청난 진보가 이루어지고있는 한 영역은 짧은 읽기 시퀀싱을 무시하는 게놈과 전 사체의 복잡성 영역을 드러내는 긴 읽기입니다. 게놈 분석에서 주요 문제는 DNA의 반복 된 서열을 다루는 것이다. 기본 판독 길이보다 긴 반복은 참조 게놈에 고유하게 매핑하는 것이 매우 어렵거나 불가능할 수 있습니다.

  transcriptome 분석에서도 비슷한 문제가 발생합니다. Uconn Health 의 Genomics 및 Personalized Healthcare 의 John and Donna Krenicki 교수 인 Brenton Gravely 박사는 “대부분의 유전자는 읽기 길이보다 mRNA에서 더 멀리 떨어져있는 다수의 대체 엑손을 포함하고 있습니다 . 따라서 특정 샘플에 어떤 isoform이 존재 하는지 정확히 알기 위해 그것을 사용하는 것은 불가능합니다 . “

• 장시간 읽기 기술

  최근 오랫동안 관심을 끌었던 Oxford Nanopore는 지난 봄에 nanopore 기반 시퀀서 인 Minions를 처음으로 만들었습니다. 옥스포드 나노 홀 (Oxford Nanopore)은 정식 제품 출시에 대한 정의를 확대 해 왔지만이 회사는 기술을 폭 넓은 잠재 고객에게 제공 할 수있게되었습니다. 1,000 개가 넘는 연구 그룹이 자체 실험실에서 Minion을 사용하고 있습니다.

  초기 릴리스 이후 1 년 이내에, Minion은 주로 나노 기공 설계 및 효소 화학의 일련의 개선을 통해 출력을 100 Mb 미만에서 1 Gb 이상으로 증가 시켰습니다. 그리고 MinION은 Illumina의 플랫폼이 출력, 품질 및 GB 당 비용 측면에서 거의 접근하지 않지만 Oxford Nanopore 장비는 읽기 길이와 이식성이라는 두 가지 주요 장점을 가지고 있습니다.

  사용자는 100Kb를 넘는 개별 읽기를보고했으며 수만 건의 기본 읽기 길이를 기록했습니다. DNA 입력 품질과 라이브러리 준비가 판독 길이를 제한하는 유일한 실제 요소 인 것처럼 보입니다. 나노 크기의 긴 DNA 분자를 먹이면 오래 읽힐 것입니다.

  Minion은 핸드 헬드 시퀀서 (최적 크기의 비교기 – 스테이플러, USB 스틱, 스마트 폰, 초콜릿 바 등을 다루는 팬들과 함께)이기 때문에 데이터가 수집되는 필드로 시퀀서를 가져갈 수도 있습니다 샘플을 실험실로 가져온 후 샘플을 처리하는 것이 아닙니다.

  데이터 품질은 Illumina보다 훨씬 뒤떨어 지지만 시간이 지남에 따라 향상되고 있습니다. “빠른 모드”의 최신 R9 기공은 최상의 조건에서 최대 95 %의 정확도를 제공합니다.

  Pacific Biosciences는 장기 판독 시퀀싱의 선두 주자로서 자체 흥분을 불러 일으켰습니다. 이 회사는 지난 해 ASHG에서 중요한 새로운 플랫폼 인 Sequel을 발표했습니다. Roche와의 협력의 결과 인이 플랫폼은 교체되는 기계 인 RS II에 대한 몇 가지 개선 사항을 약속합니다.

  T 그 속편은 RS II와 비교하여, 칠중 큰 출력을 생성 2/3 공간을 적게 차지하며 절반 자본 비용을 요구한다. Pacific Biosciences는 화학적 문제와 공급 문제, 특히 소모성 SMRT (단일 분자, 실시간) 셀 모두를 다루면서 플랫폼을 완전히 출시하기 위해 조금 노력했습니다. 두 가지 문제가 모두 해결 된 것으로 보이므로 우리는 고객이 생성 한 첫 번째 데이터를 기다리고 있습니다.

  이 공간에서 파도를 만드는 다른 플레이어는 10X Genomics이며 GemCode ™ 기술로 기본 짧은 읽기 데이터에서 링크 된 읽기를 생성 할 수 있습니다. 이 기술은 진정한 장시간 읽기의 모든 이점을 가지고 있지는 않지만 (예를 들어 기본 짧은 읽기보다 더 긴 반복을 지원할 수는 없습니다), 링크 된 읽기는 완전히 새로운 방식의 조립 및 단계적 읽기를 생성 할 수 있습니다.

  이 플랫폼 은 일루미나가 자신의 Moleculo 합성 장시간 판독 기술의 죽음을 조용히 신호한다면, 일리노이가 올해 초 10X Genomics와 공동 마케팅 계약을 체결 한 것으로 충분할 것으로 보인다 .

  모든 진전에도 불구하고, 특히 트랜스 스크립트 체 시퀀싱 (transcriptome sequencing)과 같이 장시간 읽기 (long-read) 기술에 대한 문제가 있습니다. “문제 중 하나는 이러한 플랫폼의 현재 처리량이지만 더 큰 문제는 역전사 효소가 충분히 공정하지 않다는 것입니다.”라고 Gravely 박사는 설명합니다. Transcriptome 연구진은 최근에 RNA를 직접 염기 서열로 염색하기 위해 Minion을 사용하는 논문을 발표 한 Oxford Nanopore가 RNAi를 발사 할 계획이 있음을 기쁜 마음으로 알게 될 것이다. 장래에 상용 키트.

• 단일 세포 유전체학

  많은 견인력을 얻고있는 또 다른 응용 분야는 단일 세포 유전체학입니다. 최근까지만해도 모든 NGS 프로젝트 (드물게 예외적으로)는 단일 시퀀싱 라이브러리의 경우 수천 개의 셀에서 최대 백만 개의 셀까지 다양한 셀이 혼합되어 수행되었습니다. 일반적으로 체세포 게놈의 경우와 같이 모든 세포가 완전히 균질하다면 이것은 실제로 문제가되지 않습니다. 그러나 셀이 균질하지 않은 여러 응용 프로그램이 있으며이를 함께 모아 중요한 정보를 숨 깁니다.

  예를 들어, 종양 생검은 체세포와 암세포 모두를 포함하여 이질적으로 악명이 높습니다. 그리고 동일한 종양의 암 세포조차도 실질적으로 다른 게놈을 가질 수 있습니다. 여러 개의 세포를 함께 모으는 것은 혼합 된 게놈 프로필을 생성하여 해석을 복잡하게합니다. 적은 수의 셀에만 존재하는 변형은 완전히 가려 질 수 있습니다.

  시도를 시작하는 전략 은 생검 내 다른 위치에서 여러 개의 단일 세포 측정을하는 것입니다. 충분한 개별 측정이 이루어지면 종양 게놈의 포괄적 인 견해가 형성 될 수 있습니다.

  Transcriptomics는 단일 세포 접근법의 이점을 얻기 시작한 또 다른 응용 프로그램 입니다. 전 사체는 세포마다 매우 다양 할 수 있으며, 함께 세포를 풀면 유전자 발현 패턴의 기본 가변성이 흐려질 수 있습니다.

  “몇 년 전, 수백 개의 단세포에 대한 transcrip tomics 분석은 상당한 자원과 시간을 필요로했을 것입니다.”라고 Illumina를 RS 과학 벤처 (RS Technology Ventures)에서 발견 한 유전학 자이자 기업가 인 Richard Shen 박사는 말합니다. “이제는 사용하기 쉬운 NGS 라이브러리 준비 방법의 개발과 시퀀싱 비용의 감소로 수천 개의 단일 세포 분석이 가능할뿐 아니라 많은 응용 분야에서 바람직합니다.”

  단일 세포 라이브러리를 준비 할 때 한 번에 800 개의 세포를 처리 할 수있는 Fluidigm의 ​​C1과 한 번에 놀라운 48,000 개의 세포까지 처리 할 수있는 10X Genomics의 Chromium ™을 포함하여 여러 플랫폼을 사용할 수 있습니다. 그러나 Gravely 박사는 “새로운 플랫폼이나 수제 장치의 처리량은 매우 흥미 롭지 만 접합을 위해 노력하는 사람에게는 성배가 단 하나뿐이기 때문에, 셀, 장시간 읽기 시퀀싱. “

• 암 액체 생검

  또 다른 주목할만한 NGS 개발은 암 진단을위한 액체 생검의 도입입니다. NGS의 사용은 Foundation Medicine의 FoundationOne 테스트가 주요한 예가되는 암 종양 생검의 진단에서 다소 일상적으로되어 가고 있습니다. 315 개의 암 관련 유전자가 하나의 테스트로 결합 된 타겟 패널입니다. 이러한 패널 기반 검사는보다 전통적인 단일 유전자 검사를 대체합니다.

  암 진단은 또한 종양 생검에서 액체 생검으로 이동합니다. 종양의 한 부분에서 DNA를 추출하는 대신 암 액체 생검은 순환하는 종양 세포 (CTCs) 또는 환자의 혈액에서 무 세포 DNA (cfDNA)를 추출하는 것과 관련이 있습니다. 고형 종양 생검은 해부학 적 구조와 세포 구조 정보로 인해 사라지지 않을 것이지만, 다목적 성을 이유로 액체 생검에 대한 많은 흥미 진진한 경험이 있습니다.

  “암 검진의 관점에서, 액체 생검은 암을 조기에 발견하기 위해 일상적으로 수행 할 수있는 간단하고 정확한 (잠재적 인) 사전 검사를 나타내는 것이기 때문에 매력적이다”라고 액체 생검인 프 롤롬 (Freenome)의 CEO이자 공동 설립자 인 가브리엘 오트 (Gabriel Otte) 회사. “예후 또는 환자 모니터링의 관점에서 볼 때 유사한 이유로 흥미 롭습니다. 그러나 다양한 이유로 침습적으로 생검 할 수없는 암 사례의 최대 30 %는 특히 그렇습니다.”

  뜨거운 새로운 분야에서 예상 되듯이, 몇몇 새로운 회사가 형성되고 있으며,보다 많은 기존 회사들이 커지고 성장하는 시장이 될 것으로 예상되는 것을 활용하기 위해 재구성하고 있습니다. AllSeq은이 분야에서 35 개 이상의 회사를 추적하고 있습니다.

  Guardant Health는 자사의 암 액체 생검 진단이 2014 년 초에 시장에 출시 된 첫 번째 시장이라고 주장합니다. Guardant360이라고하는이 진단은 70 가지 암 유전자를 조사합니다. Freenome은 전체 암 게놈을 시퀀싱함으로써 다른 전략을 취하고있다. Otte는 “정확한 암 테스트에 가장 적합한 특정 하위 영역을 파악하기 위해 깊은 학습에 의존하고 있습니다.”라고 말했습니다.

  이 회사의 시퀀싱 기술을 사용하는 Illumina는 자체 액체 생검 회사 인 Grail을 분사하여 게임에 참여하기를 원한다고 결정했다. 그러나 Illumina는 자체 고객과 직접 경쟁하는 모습을 피하기 위해 Grail은 다른 회사 중 아직 집중하지 못한 훨씬 어려운 과제 인 사전 증상 검사에 집중할 것이라고합니다.

  Illumina는 높은 처리량의 짧은 읽기 시장을 지속적으로 장악하고있는 것처럼 보이지만 다른 분야의 발전을 위해 눈을 떼지 않습니다. Oxford Nanopore는 높은 처리량의 nanopore 시퀀서 인 Promethion을 포함하여 많은 출시 예정을 발표했습니다. 이 회사는 Illumina의 HiSeq X와 경쟁 할 수있는 처리량이 있다고 주장합니다. Promethion은 현재 2 ~ 3 명의 조기 접속 고객의 손에 달려 있지만 아직 확정 된 확정일은 아직 없습니다. Oxford Nanopore는 DNA 샘플 시퀀싱의 전체 프로세스를 더욱 단순화 할 것으로 약속 한 VolTRAX 및 Zumbador와 같은 샘플 핸들링 자동화 도구에 대해서도 언급하고 있습니다. 우리는 또한 Pacific Bioscience의 Sequel 플랫폼이 얼마나 빨리 채택되는지 살펴보고자합니다. Illumina에서 사업을 시작하기에 충분한 시간이 걸릴 수도 있습니다. 마지막으로, 우리는 NGS의 임상 적용에 주목하고 있습니다. 사용 편의성과 비용 절감이 꾸준히 개선됨에 따라 임상 채택의 장벽은 이제 규제 및 보상에 더 집중하는 경향이 있습니다.