클리닉의 차세대 시퀀싱

유전체 검사에 적용된 차세대 시퀀싱 ( NGS )은 임상의에게 환자 표본을 더 잘 진단 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다. NGS는 이전 모델 인 Sanger 시퀀싱에 비해 높은 처리량과 작은 샘플 요구 사항의 이점을 제공합니다. 지난 몇 년 동안 전체 게놈 시퀀싱 (WGS), 전체 – exome 시퀀싱 (WES) 및 대상 시퀀싱 어플리케이션에 NGS를 사용하는 의료 센터에서의 게놈 테스트 기능이 급속히 확대되었습니다. 오늘날 연구원과 임상의는 NGS를 사용하여 돌연변이, 복제 수 변경 및 융합에 대한 수백 개의 유전자를 검사 할 수 있습니다. NGS가 클리닉에서 어떻게 사용되는지, 그리고 기업이 임상 연구 및 진단 필요를 충족시키는 NGS 도구를 제공하는 방법을 살펴보십시오.

임상 의사 결정에 NGS 사용

치료 과정이나 실행 가능한 변경에 영향을 미치는 특정 게놈 변형이 임상의에게 가장 중요합니다. 많은 임상의는 치료 지침으로 유용 할 때만 유전 검사를 사용합니다. 단지 소수의 유전자 변형이 승인 된 약물과 관련되어 있지만, 또 다른 옵션은 임상 시험입니다. 텍사스 대학교 MD 앤더슨 암 센터 (MD Anderson Cancer Center)의 연구 암 치료제 학과장 인 Funda Meric-Bernstam은 “우리는 환자의 종양에 특정한 유전 변이가 필요하다는 거의 100 건의 임상 시험을 실시했다. 오늘날 대부분의 임상 의사 결정은 환자의 상태와 관련된 특정 변경을 찾는 exome 기반 NGS 패널을 사용하여 안내합니다. 일부 NGS 패널은 유방암 또는 고형 종양에 대한 패널과 같은 돌연변이 모음을 테스트합니다. 특정 phenotypes 또는 종양의 클래스를 테스트하는 데 자주 사용되는 작은 유전자 패널은 제한된 복잡성의 명확한 결과를 산출합니다. Mayo 클리닉의 Clinical Genome Sequencing Laboratory의 임상 분자 유전학 자이자 수석 디렉터 인 Matthew Ferber는 다음과 같이 말합니다. “이것은 적절한 학문 분야 전문 지식을 갖춘 대부분의 의사가 사용할 수있게 해줍니다. 대조적으로 대형 유전자 패널과 WES는 처음에는 환자와 만나는 것에서 최종 결과를 해석하는 것까지 과정을 관리하는 더 큰 학제 간 팀이 필요합니다. 환자를 진단 할 때 오류의 결과가 급격 할 수 있습니다. 따라서 임상 실험실은 다른 NGS 시스템이나 기존의 Sanger 방법을 사용하여 대체 플랫폼에서 변경 사항을 확인하는 데 많은 시간을 소비합니다. “아직 표준은 생거 시퀀싱 (Sanger sequencing)입니다.”라고 로스 엔젤레스 아동 병원의 게놈 의학 부서장이자 캘리포니아 남부 캘리포니아 대학의 임상 병리학 교수 인 Jaclyn Biegel은 말했다. . “희귀 질환을 가진 어린이를 진단하려는 임상 진단 환경에서 whole-exome sequencing을 위해 우리는 Sanger의 병원성 변종을 확인합니다.” 위스콘신 의과 대학 인간 및 분자 유전학 센터의 발달 및 신경 발생학 연구소 소장 Ulrike Kappes는 또한 Sanger 시퀀싱을 사용하여 NGS 결과를 확인합니다. Kappes 팀은 신경 발달 장애와 같은 드문 질환을 진단하기 위해 전체 exome 및 게놈 시퀀싱에서 NGS를 사용합니다. Kappes는 “Exome과 게놈 시퀀싱은 유전자 구성 요소가 강력하게 의심 될 때 우리 환자를위한 임상 시험의 일부이지만 다른 검사는 진단을 제공하지 못했습니다. Biegel의 그룹은 exome sequencing이 종종 발견하지 못하는 염색체 재조합을 테스트하기 위해 소아 종양학 검체에 대한 전체 게놈 시퀀싱의 사용을 개발하고 있습니다. “전체 exome 시퀀싱만으로는 너무 많은 것들을 놓치기 때문에 암 표본에서의 재 배열을 신체적으로 검출하기 위해 전체 유전체 시퀀싱을 뛰어 넘을 것입니다.”라고 Biegel은 말합니다. 하지만 모든 환자에게 전체 게놈 시퀀싱을 수행하는 데 필요한 복잡한 생물 정보학을 피하기 위해 먼저 패널을 사용합니다.

NGS 도달 범위 확대

현재 NGS 검사의 대부분은 조직 기반이지만 액체 생검에 대한 관심이 높아지고 있습니다.

장점은 비 침습적 샘플링 (예 : 혈액 추출)과 시간 경과에 따른 환자 연구를위한 연속 샘플링의 가능성입니다. 혈액 샘플은 접근하기 어려운 종양의 생검보다 훨씬 쉽게 획득 할 수 있습니다. 이전에 다른 곳에서 치료받은 환자의 경우 보관 조직 샘플을 옮기면 치료가 지연 될 수 있으며 새로운 생검을 수행하는 것은 더 침해적이고 비용이 많이 듭니다. “또한 생체 검사를받는 환자의 약 15 %는 게놈 검사를 용이하게하기에 충분한 조직이 없다”고 Meric-Bernstam은 말합니다. “액체 생검을 선택하면 환자의 유전 검사 옵션이 향상 될 것입니다.” Cynvenio는 종양 유도 세포와 환자의 혈액에 존재하는 DNA 단편을 사용하는 액체 생검에서 종양 신호를 평가하는 방법을 개발했습니다. Cynvenio의 플랫폼은 종양 세포를 풍부하게하고 혈액 순환 세포없는 DNA (ccfDNA, 죽거나 죽어가는 세포에서 방출되는 DNA) 및 순환하는 종양 세포 DNA ( ctcDNA , 종양에서 유래 한 손상되지 않은 세포 의 DNA)에서 두 가지 유형의 DNA를 정제 합니다. 혈액) – 다른 종류의 정보를 제공합니다. Cynvenio는 또한 ccfDNA와 ctcDNA 모두를 시퀀싱함으로써 혈액 샘플에서이 질병의 특징을 찾도록하는 3 중 음성, 유방암 관련 시퀀싱 패널을 개발했습니다. 현재 Cynvenio는 삼중 음성 유방암에서 30 %의 재발률을 보이는 공격적인 환자의 연구에서 이러한 도구를 사용하고 있습니다. 이 회사는 유방암 재발에 대한 분자 증거를 모니터링하기 위해 혈액 샘플에 대한 NGS 평가를 시간 경과에 따라 사용합니다. 임상 시험은 임상 재발과의 연관성을 확립하고자합니다. CTC는 임상 증후조차 전에 조기에 발견 될 수 있습니다. “이 정보는 의사가 각 환자에 대해 앞으로 나아갈 수있는 최선의 방법을 결정하는 데 도움이되는 증거 기반 정보를 제공하는 데 사용될 수 있습니다.”라고 Cynvenio의 수석 과학 책임자 인 Paul Dempsey는 말합니다.

향후 응용 프로그램을위한 NGS 도구

연구원과 임상가는 현재의 NGS 기술의 한계를 계속해서 압박하고 있습니다. 예를 들어, 인간 게놈의 일부는 NGS를 사용하여 서열을 결정하기가 어렵습니다. Kappes는 “복제 수 변이, 긴 반복 서열, 구조적 염색체 재조합, 배수체, GC가 풍부한 영역, 후성 유전학 효과 또는 모자이크를 포함합니다. NGS는 또한 paralogous 유전자 및 pseudogenes와 같은 다른 지역과 높은 서열 상 동성을 갖는 게놈의 영역에서 변이체를 확인하는 데 있어서는 제한적입니다. Kappes는 “특정 유전자와 다양한 유전자의 특정 엑손에 대해서는 여전히 이러한 영역을 분석 할 수있는 판독 범위 또는 판독 범위가 충분하지 않습니다.

연구자들은 클리닉에서 NGS의 강점을 발휘하는 혁신적인 도구와 분석법을 개발하기 위해 기업과 공동으로 노력하고 있습니다.

Biegel은 Thermo Fisher Scientific과 협력하여 소아 종양학 환자를위한 NGS 패널을 개발했습니다. “Thermo Fisher의 AmpliSeq Oncomine 연구 패널은 유년기 암에 대한 충분한 내용을 포함하지 않았습니다.”라고 Biegel은 말합니다. 그녀의 그룹은 모든 소아 종양 유형에 대한 바이오 마커가 포함 된 종합 NGS 패널을 공동 개발하고 있습니다. 여전히 검증 된이 패널은 Thermo Fisher의 고 처리량 Ion Torrent NGS 플랫폼과  AmpliSeq  기술을 사용합니다. 단지 나노 그램의 시작 샘플이 필요합니다. Biegel은 “DNA와 RNA가 결합 된 플랫폼이므로 전좌와 변이를 선택할 수 있습니다. 연구 용도로만 지정된 일부 NGS 도구는 임상 도구 개발에 점점 더 가치가 있습니다. Promega는 라이브러리로 들어오는 DNA를 정량화하기위한 연구 전용 도구를 제공하며 샘플 저하 수준을 확인하기위한 품질 관리 분석을 개발 중입니다. 샘플 DNA의 품질과 크기를 알면 연구자는 샘플에서 가능한 한 많은 정보를 얻을 수 있습니다. “연구자들이 품질이 좋지 않고 귀중한 샘플을 가지고 작업 할 때, 예를 들어 가장 유용한 정보를 얻으려면 가장 중요한 유전자 만있는 작은 [NGS] 패널을 사용하기로 결정할 수 있습니다.”라고 Curtis Knox는 다음과 같이 전했다. Promega의 NGS. 액체 생검에 대한 관심이 증가하는 가운데, QIAGEN의  GeneReader  시스템은 현재 연구용으로 만 사용되어 임상 연구자가 실행 가능한 정보 검색 범위를 좁히는 데 도움이됩니다. QIAGEN의 종양학 프랜차이즈 사업 리더 인 조나단 아놀드 (Jonathan Arnold)는 “연구 전용 (research-use-only) [도구]의 목적은 향후 진단 도구의 개발을 가능하게하는 것입니다. QIAGEN의 QIAact 실용적인 통찰 종양 패널은 일반적인 암 유형에서 12 개의 유전자와 1,250 개의 유전자 변이를 표적으로합니다. 최근에이 회사는 액체 생검 플라즈마 시료 용 패널을 출시했습니다. QIAGEN은 또한 폐암 및 유방암과 난소 암에 대한 추가 QIAact 패널을 개발 중이다. 연속 비용이 계속 떨어지더라도 비용은 여전히 ​​임상 상황에서 NGS의 채택 확대에 영향을 미치는 한계입니다.

더 복잡한 장애물은 임상 환경에서 NGS 결과를 해석 할 수있는 복잡한 시스템과 학제 간 전문가 팀이 필요하다는 것입니다.

“[NGS 테스트]는 누군가가 더 저렴하고 빠른 시퀀서를 발명 할 때까지 중요한 부분에서 벗어나지 않을 것입니다. 더 중요한 것은 샘플 준비에서 변형 해석 및 보고서 생성을 통해 개인 또는 2 명이 관리 할 수 ​​있다는 것입니다.”라고 Ferber는 말합니다 “언젠가 데이터 분석 요구 사항이 관리하기가 훨씬 더 어려워지기를 바랍니다.” 메이요 클리닉 (Mayo Clinic)의 Ferber 프로그램은 NGS 테스트 요청이 증가함에 따라 빠르게 성장했습니다. “비용이 많이 들고 어렵고 시간이 많이 걸리지 만 10 년 넘게 해결할 수없는 사례를 통해 일할 때 가족이 무수히 많은 의사를 방문하고 엄청난 돈을 지출하는 등의 작업을 할 때 모두 사라집니다. 대답을 찾는다. “그것이 가치있는 일이라는 것을 당신이 알고있을 때입니다.”